Diferenciar células 3T3-L1 a adipocitos maduros
Este procedimiento involucra a todo el personal técnico, científico y estudiantes que realicen cultivo celular y que necesiten diferenciar células 3T3-L1 a adipocitos en la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Hospital Infantil de México Federico Gómez
Es responsabilidad de todo el personal científico, estudiantes y técnicos adscritos a la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Hospital Infantil de México Federico Gómez conocer y dar seguimiento a este procedimiento. Los residuos de tipo CRETI (Corrosivas, Reactivas, Explosivas, Toxicas e Inflamables) se deberán eliminar con base en su clasificación y especificaciones de manejo según la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002; así como sus características intrínsecas y su toxicidad al ambiente según la NOM-052- SEMARNAT-2005
Descripción del Protocolo
- Extraer del tanque de N líquido un criovial de células 3T3-L1. Esperar a que el criovial se descongele un 60%, y verterlo en un tubo con 5 mL de Medio de crecimiento (MC). Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos. Decantar el sobrenadante. Agregar al tubo 5 mL de MC y re-suspender las células para transferirlas a su respectiva botella tratada. En el caso de utilizar una botella de 25cm2, no será necesario añadir más MC. En el caso de botellas de 75cm2, añadir 5mL adicionales de MC. Incubar a 37ºC, 5 % CO₂ y 95 % humedad. Una vez que las células presenten una confluencia mayor al 80%, será necesario cosecharlas. Decantar el MC. Lavar 2 veces la monocapa de células con 3 mL de PBS 1X. Agregar 5 mL de EDTA 2mM e incubar a 37°C por 10 minutos. Agitar la botella para separar bien las células. Agregar 5 mL de MC para inactivar el EDTA 2mM. Transferir a un tubo Falcon de 10mL. Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos. Decantar el sobrenadante, y re-suspender las células en 1mL de MC. Tomar 10 μL de la suspensión celular para realizar el conteo celular por el método de hemocitometría. (Se sugiere realizar una dilución 1:10). En función de la placa de cultivo tratada a utilizar, añadir:
Incubar por aproximadamente 18 horas o hasta que se forme la monocapa de células. Una vez formada la monocapa, retirar todo el medio y agregar Medio de diferenciación (MD) l, incubar por 4 días. Es importante revisar el cultivo cada 24 horas para realizar el cambio del MD correspondiente cuando resulte necesario. Una vez transcurrido el tiempo, retirar el 80% del medio y agregar MD-II, incubar por 4 días. Transcurrido el tiempo, retirar el 80% de MD-II y añadir MD-III, incubar por 4 días. Terminado el tiempo de incubación con el MD-III, retirar el 80% del medio y agregar MC e incubar por 1 semana.
La presencia de gotas de lípidos podrá ser observadas en las células a partir del día 8. Durante la diferenciación de las células se observará un cambio morfológico, aproximadamente en el día 12. Es importante revisar el cultivo cada 24 horas para realizar el cambio del MD correspondiente cuando resulte necesario. Durante el proceso de diferenciación no debe perderse más del 10% de células
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Preparación de medios. a) Medio de crecimiento (MC) Opti-MEM + 5% SFB + antibiótico/antimicótico + l-glutamina.
- Medios de diferenciación (MD) La siguiente tabla es descrita para cada mililitro (1 mL) de MD a preparar. Al MC se le adicionara los reactivos necesarios para preparar los medios de diferenciación:
Volumen (1mL) MD-I MD-II MD-III Dexametasona 25 μM 10 μL 10 μL — IBMX 125 μM 4 μL 4 μL — Insulina 300 UI/mL 0.3 μL 0.3 μL 0.3 μL Rosiglitazona 20 mM — 1 μL de una dilución 1:10 (9 μL de medio de crecimiento + 1 μL de rosiglitazona 20 Mm) —
- Medio de crecimiento
Medio DMEM + 10% SFB + antibiótico/antimicótico + l-glutamina
- Medios de diferenciación (MD)
Al medio de crecimiento se le adicionara los reactivos necesarios para preparar los medios de diferenciación. La siguiente tabla es descrita para 3 mL de medio, es decir para un pozo.
| MD-I | MD-II | MD-III | |
|---|---|---|---|
| Dexamentasona | 25 \(\mu\)M | 30 \(\mu\)L | 30 \(\mu\)L |
| IBMX | 125 \(\mu\)M | 12 \(\mu\)L | 12 \(\mu\)L |
| Insulina 300 UI/mL | 1 \(\mu\)L | 1 \(\mu\)L | 1 \(\mu\)L |
| Rosiglitazona 20 mM | 3 \(\mu\)L1 | 3\(\mu\)L | 3 \(\mu\)L |
Cantidad de células
Placa de cultivo Células Medio de Crecimiento 6 pozos 1x105 células / pozo 3 mL 12 pozos 5x104 células / pozo 2 mL 24 pozos 5x104 células / pozo 1 mL 48 pozos 5x104 células / pozo 1 mL
Documentos de referencia
Zebisch K, Voigt V, Wabitsch M, Brandsch M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Analytical biochemistry. 2012;425(1):88-90. Zebisch K, Voigt V, Wabitsch M, Brandsch M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Analytical biochemistry. 2012;425(1):88-90.
Notas
de una dilución 1:10 (9\(\mu\)L de medio de crecimiento + 1\(\mu\)L de rosiglitazona 20 Mm)↩︎