Separar las moléculas de ADN de acuerdo con su peso molecular a través de geles de agarosa
Este procedimiento involucra a todo el personal técnico, científico y estudiantes que necesiten separar moléculas de ADN a través de geles de agarosa en la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Instituto Nacional de Salud Hospital Infantil de México Federico Gómez
Es responsabilidad de todo el personal científico, estudiantes y técnicos adscritos a la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Hospital Infantil de México Federico Gómez conocer y dar seguimiento a este procedimiento. Los residuos de tipo CRETI (Corrosivas, Reactivas, Explosivas, Toxicas e Inflamables) se deberán eliminar con base en su clasificación y especificaciones de manejo según la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002; así como sus características intrínsecas y su toxicidad al ambiente según la NOM-052- SEMARNAT-2005
Descripción del Protocolo
- Determinar el porcentaje de gel a preparar en base al tamaño de la molécula de ADN a analizar (Tabla 1).
- Pesar la cantidad de agarosa UltraPure de Invitrogen requerida para la resolución deseada.
- Disolver en 100ml de TAE 1X. Agitar.
- Calentar la agarosa hasta que se disuelva por completo. Agregar 4µl de SYBR Safe 10,000X de Invitrogen.
- Sellar completamente la cama para preparación de geles de agarosa con cinta adhesiva y posteriormente vaciar la agarosa en la cama.
- Colocar el peine y dejar que solidifique la agarosa. Una vez solidificado retirar la cinta adhesiva y el peine y colocar la cama dentro de la cámara de electroforesis.
- Agregar 200ml de TAE 1X (cubrir entre 0.5 o 1 cm por encima del gel).
- Mezclar las muestras de interés con buffer de carga 6X DNA Loading Dye y colocar en cada pocillo cada una de las muestras.
- Colocar el marcador de peso molecular (marcador de peso molecular + buffer de carga 6X DNA Loading Dye) en un pocillo.
- Cerrar la cámara de electroforesis y conectar a la fuente de poder.
- Encender la fuente de poder, seleccionar voltaje constante de 100V y migrar durante 20 minutos.
- Analizar el gel en el fotodocumentador utilizando el programa SYBR Safe.
- Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas debajo de los peines y de ser así, eliminar antes de correr el gel.
- Permitir al polvo de la agarosa hidratarse en la solución durante unos minutos antes de calentar: esto permite una disolución más sencilla, rápida y reduce la formación de espuma.
- Para prevenir el sobrecalentamiento de la agarosa, si se usa un microondas sacar el vaso de precipitados después de 1 minuto y mover cuidadosamente. Volver a colocar dentro del microondas y continuar 1 minuto más. Si se hierve demasiado tiempo puede causar hidrólisis y una fuerza de resolución del gel menor.
Diagrama de Flujo
Anexos
geles
| Tamaño (kb) | Concentración |
|---|---|
| >2 | 0.6% |
| 1-2 | 0.8% |
| 0.5-1 | 1% |
| 0.2-0.5 | 1.5% |
| <0.2 | 2% |
Reactivos y Soluciones
- Reactivos
- UltraPure Agarose de Invitrogen
- SYBR SAFE
- Buffer carga 6X DNA Loading Dye
- Marcador de peso molecular
- TAE 1X
- TAE
| 1X | 50X | |
|---|---|---|
| Tris | 40 mM | 242 g |
| Ácido Acético | 20 mM | 57.1 mL |
| Na2EDTA-2H2O | 1 mM | 18.61 g |
| dH2O1 | 1 L | 1 L |
Documentos de referencia
- Gründemann D., Schömig E. 1996. Protection of DNA During Preparative Agarose Gel Electrophoresis Against Damage Induced by Ultraviolet Light. Research Reports, 21(5):898-903.
- Current Protocols in Molecular Biology, Appendix 2, A.2.5, Supplement 40, Frederick M. Ausubel et al. 2003.
Notas
aforar a↩︎