Tinción para citometría de flujo

UIEEN-PT-001

Autores/as
Afiliaciones

Diana Villalpando Sánchez

Tuneado por

Oscar Medina Contreras

Revisó

Oscar Medina Contreras

Autorizó

Fecha de publicación

11 de octubre de 2025

NotaPropósito

Realizar una tinción de superficie e intracelular de células linfoides para su posterior análisis por citometría de flujo

NotaAlcance

Este procedimiento involucra a todo el personal técnico, científico y estudiantes que deseen Realizar una tinción de superficie e intracelular de células linfoides para su posterior análisis por citometría de flujo en la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Instituto Nacional de Salud Hospital Infantil de México Federico Gómez.

NotaPolíticas de operación, normas y lineamientos

Es responsabilidad de todo el personal científico, estudiantes y técnicos adscritos a la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Hospital Infantil de México Federico Gómez conocer y dar seguimiento a este procedimiento. Los residuos de tipo CRETI (Corrosivas, Reactivas, Explosivas, Toxicas e Inflamables) se deberán eliminar con base en su clasificación y especificaciones de manejo según la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002; así como sus características intrínsecas y su toxicidad al ambiente según la NOM-052- SEMARNAT-2005

Descripción del Protocolo

NotaPasos

Tinción de superficie  Colocar 1 x10⁶ células en tubos para citometría de flujo.  Centrifugar a 1500rpm / 5 minutos / 4°C.  Re-suspender en 200µL de solución FACS (PBS 1X y SFB 2%).  Colocar anticuerpos de superficie titulados, incubar 30 minutos / obscuridad / 4ºC.  Lavar con 1mL de solución FACS.  

 Centrifugar a 1500 rpm / 5 minutos / 4°C.  Adicionar 500 µL de solución fijadora (BioLegend) o en su defecto, 100 µL de paraformaldehído 4%.  Incubar 20 minutos / obscuridad / 4ºC.  Lavar con 1mL de solución FACS.  Centrifugar 1500rpm / 5 minutos / 4°C.  Decantar el sobrenadante y re-suspender las células en 200µl de solución FACS.  Analizar la muestra inmediatamente o en los 2 días posteriores a la tinción.  Conservar la muestra hasta realizar el análisis.

Tinción intracelular  Realizar tinción de superficie.  Re-suspender las células en 1mL de buffer de permeabilización (BioLegend).  Incubar 5 minutos / 4ºC.  Lavar con 1mL de buffer de permeabilización (BioLegend).  Centrifugar 1500rpm / 5 minutos / 4°C.  Colocar anticuerpos intracelulares titulados.  Incubar 30 minutos / obscuridad / 4ºC.  Lavar con 1mL de buffer de permeabilización (BioLegend).  Centrifugar 1500rpm / 5 minutos / 4°C.  Re-suspender el pellet en 200µL de solución FACS.  Analizar la muestra inmediatamente o en los 2 días posteriores a la tinción.  Conservar la muestra hasta realizar el análisis.

Diagrama de Flujo

Figura 1. Diagrama de flujo

Anexos

Reactivos y Soluciones

  1. Reactivos
  • UltraPure Agarose de Invitrogen
  • SYBR SAFE
  • Buffer carga 6X DNA Loading Dye
  • Marcador de peso molecular
  • TAE 1X
  1. TAE
Tabla 1: Preparación de TAE
1X 50X
Tris 40 mM 242 g
Ácido Acético 20 mM 57.1 mL
Na2EDTA-2H2O 1 mM 18.61 g
dH2O1 1 L 1 L

Documentos de referencia

Bushnell, T. Modern Flow Cytometry. 1–67 (Excyte, 2015).

Notas

  1. aforar a↩︎