Conocer de manera cuantitativa la expresión de un gen o genes de interés de en una muestra de cDNA.
Este procedimiento involucra a todo el personal técnico, científico y estudiantes que necesiten conocer la expresión de un gen o genes de interés en una muestra de cDNA en la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Instituto Nacional de Salud Hospital Infantil de México Federico Gómez
Es responsabilidad de todo el personal científico, estudiantes y técnicos adscritos a la Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición del Hospital Infantil de México Federico Gómez conocer y dar seguimiento a este procedimiento. Los residuos de tipo CRETI (Corrosivas, Reactivas, Explosivas, Toxicas e Inflamables) se deberán eliminar con base en su clasificación y especificaciones de manejo según la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002; así como sus características intrínsecas y su toxicidad al ambiente según la NOM-052- SEMARNAT-2005
Descripción del Protocolo
- Para amplificar cada gen de interés, añadir a un microtubo o pozo de placa de PCR 5uL de qPCRBIO SyGreen Mix. Añadir 1 µL del primer Fw (10 mM) y 1 µL del primer Rv (10 mM). Adicionar el volumen de muestra que contenga < 1µg de DNA genómico o <100ng de cDNA (entre 1 - 3 µL). Añadir H2O mQ cbp realizar la amplificación en un volumen total de 10 µL. Homogenizar bien. En caso de formarse burbujas, dar spin de 1 min para concentrar todo el volumen en el fondo del microtubo o del pozo de la placa de PCR. Sellar el microtubo con su tapa, o la placa con una película plástica adhesiva. Analizar las muestras siguiendo la programación de la reacción se muestra en la tabla 2 de los Anexos.
- Homogeneizar cada reactivo antes de adicionarlo. Durante el proceso mantener todos los reactivos en hielo. Realizar la preparación en un periodo de tiempo corto. Considerar evaluar cada gen o muestra por triplicado. Asegurarse de evaluar el gen constitutivo como control de referencia.
Diagrama de Flujo
Anexos
geles
Componente Volumen final 10 µL SYBER green Master Mix qPCR 5 µL Primer Fw (10 mM) 1 µL Primer Rv (10 mM) 1 µL cDNA cbp < 100ng Agua MiliQ cbp volumen total 10 µL
: Tamaño de ADN y porcentaje de gel {#tbl-gel}
Paso Temperatura Tiempo Ciclos Activación de la polimerasa 95°C 2 minutos - Desnaturalización Alineación y extensión 95°C 65°C 5 segundos 30 segundos 40
Reactivos y Soluciones
- Reactivos
- qPCRBIO SyGreen Mix. Primer Fw 10 mM Primer Rv 10 mM Agua MiliQ
- TAE
| 1X | 50X | |
|---|---|---|
| Tris | 40 mM | 242 g |
| Ácido Acético | 20 mM | 57.1 mL |
| Na2EDTA-2H2O | 1 mM | 18.61 g |
| dH2O1 | 1 L | 1 L |
Documentos de referencia
- Gründemann D., Schömig E. 1996. Protection of DNA During Preparative Agarose Gel Electrophoresis Against Damage Induced by Ultraviolet Light. Research Reports, 21(5):898-903.
- Current Protocols in Molecular Biology, Appendix 2, A.2.5, Supplement 40, Frederick M. Ausubel et al. 2003.
Notas
aforar a↩︎